概述
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近年来，嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法治疗血液恶性肿瘤成为细胞治疗的一项重大突破。迄今为止，美国食品和药物管理局（FDA）已经批准了六种CAR－T疗法，用于治疗非霍奇金淋巴瘤、B细胞急性淋巴细胞白血病和多发性骨髓瘤。
目前，注册的大多数临床试验都基于所谓的第二代CAR，其由一个细胞外抗原结合区、一个共刺激域和一个CD3z信号域组成。不幸的是，尽管总体治疗效果显著，但仍有相当高比例的患者没有从CAR－T治疗中获益，总体应答率在50％至100％之间，由于应答的持久性有限，后续复发率高达66％。此外，它还与细胞因子释放综合征和神经毒性等不良反应有关。
免疫学和分子工程的进展推动了新一代CAR－T细胞的构建，这些细胞武装了各种分子机制，包括额外的共刺激域、安全开关、免疫检查点调节、细胞因子表达或治疗干扰分子的敲除等。从而可以克服CAR－T疗法当前的局限性，增强疗效并减少不必要的副作用。目前，许多临床试验目前正在评估新型CAR－T疗法的安全性和有效性。
CAR的结构
随着CAR－T细胞技术越来越成熟，CAR结构的组成，特别是细胞内结构域也在不断进化。第一代CAR－T细胞结构包含肿瘤相关抗原的高亲和力单链抗体（scFv）、跨膜结构域和唯一的细胞内TCR－ζ或FcR－γ结构域。G1 的临床益处有限，主要是由于其增殖能力低和体内细胞毒性有限。为了克服这一缺点，第二代CAR结构配备了额外的细胞内共刺激结构域，最显著的是CD28或TNFRSF成员4－1BB。这些CARs被证明是非常有效的，几种CAR－T产品在治疗血液瘤方面获得了监管部门的批准。
第三代CAR－T结构包含了共刺激结构域的组合，而第四代和第五代CAR－T细胞包含额外的共刺激结构域，在抗原识别时诱导表达细胞因子（例如IL－12），或包含某些细胞因子受体的细胞内结构域（例如，截短的IL－2受体β链和STAT3结合部分）。
免疫检查点调节的武装CAR－T细胞
CAR－T治疗中的免疫检查点调节旨在规避抑制性的肿瘤微环境。在血液肿瘤方面，评估该方法的所有临床试验都明确依赖于破坏程序性细胞死亡蛋白1（PD－1）途径。尽管试验数量相对较少（n＝8），但个别研究显示了调节PD－1信号的独特方法。
在NCT03258047临床试验中，研究人员使用了一种创新方法，其中PD－1融合到细胞内CD28激活域。因此， PD－L1与PD－1的结合转化为激活信号，预期会产生更有效的抗肿瘤效果。该研究涉及17名患有B细胞非霍奇金淋巴瘤的受试者。结果显示，完全缓解率（CR）和客观缓解率（ORR）分别为41．2％和58．8％。与已批准的复发／难治性（r／r）DLBCL的第二代CAR－T疗法相比（CR52％，ORR 72％），没有显示出优势。此外，NCT03932955临床试验正在研究相同的免疫检查点调节方法，目前没有任何结果。
破坏PD－1信号的另一种探索方法是重编程CAR－T细胞以分泌PD－1－Fc融合蛋白。目前，两项研究正在评估这种方法在r／r多发性骨髓瘤（NCT04162119）和r／r B细胞淋巴瘤（NCT0416 3302）中的安全性和有效性。然而，目前尚未发表任何临床数据。
在临床试验NCT04836507中，研究人员在r／r大B细胞淋巴瘤（LBCL）患者中测试了anbalcabtagene autoleucel （Anbal－cel）。这种新型CAR－T细胞产品敲除PD－1和TIGIT受体。Anbal－cel显示出令人印象深刻的结果，CR为78％。此外，还在NCT03208556临床试验中评估了PD－1的敲除。
除PD－1通路调节外，NCT04037566临床试验正在评估另一种武装CAR－T细胞构建。造血祖细胞激酶1（HPK1）表达降低的CAR－T细胞——一个阴性的细胞内免疫检查点，显示了有希望的初步结果。在所有入选患者中，72．7％的患者达到CR或CRi，与FDA批准的抗CD19疗法相当。
TRUCKs–表达细胞因子的CAR－T细胞
重定向用于通用细胞因子介导杀伤的T细胞（TRUCKs）是新一代CAR－T细胞，被设计为表达某些细胞因子，以增强CAR－T细胞的抗肿瘤效力，提高其持久性，并改变肿瘤微环境的特征。
目前，六项临床试验正在评估TRUCKs治疗血液系统恶性肿瘤。四项临床试验（NCT04381741、NCT03929107、NCT04833504、NCT03778346）正在评估表达IL－7和趋化因子CCL19的CAR－T细胞。IL－7促进T细胞的增殖和存活，而CCL19引导CAR－T细胞的肿瘤归巢。研究结果显示， r／r DLBCL的患者的CR率为4／7，ORR为5／7。此外，NCT03778346在r／r多发性骨髓瘤（MM）患者也探索了相同的方法，其中两名入选患者获得了CR（100％）。
另一种分泌细胞因子IL－18的CAR－T细胞正在NCT04684563临床试验中进行评估。IL－18在CAR－T细胞中表达以增强CAR－T细胞增殖和抗肿瘤活性。然而，IL－18也与肿瘤进展相关，因此，关于表达IL－18的CAR－T细胞在临床中的安全性的长期结果有待观察。
NCT03602157临床试验代表了在CAR－T细胞中利用细胞因子信号的不同方法。研究人员构建了一种表达CCR4的抗CD30 CAR－T细胞，用于治疗r／r霍奇金淋巴瘤和皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）。该受体与CCL17结合，进而改善CAR－T细胞向肿瘤部位的运输。霍奇金淋巴瘤队列试验的初步结果是乐观的，6名入选患者获得CR（75％），而所有患者均获得ORR（100％）。不幸的是， CTCL组没有人获得缓解。
安全开关的CAR－T细胞
常规CAR－T疗法伴随的治疗相关毒性促进了安全开关CAR－T细胞的构建。新技术使研究人员能够结合安全开关，通过在给予外源药物后诱导细胞凋亡、补体依赖性细胞毒性（CDC）或抗体依赖性细胞细胞毒性（ADCC）来清除CAR－T细胞。
将截短的表皮生长因子受体（EGFRt）结合到CAR－T细胞中是临床试验中常见的安全开关方法。EGFRt被cetuximab靶向，其能够通过CDC或ADCC去除。截至2022年8月，20项临床试验正在研究多种血液系统恶性肿瘤中基于EGFRt的CAR－T细胞。目前，没有关于在人体中启动EGFRt安全开关机制的可用数据。缺乏此类报告的原因可能是调查期间没有危及生命的不良事件。
在药效方面，在CD19阳性的恶性肿瘤中，临床试验显示了不同的初步结果。NCT03085173研究报告的总CR率为57％，DLBCL患者的CR率为88％，而CLL患者为22％。在关于B－NHL患者的临床试验中，NCT02706405的完全应答率为42％，NCT02153580中为45％，NCT01815749中为75％。
RQR8自杀基因是治疗给药后控制CAR－T细胞的类似方法。RQR8基因编码源自CD20和CD34抗原表位的细胞表面蛋白。该策略能够在给予rituximab后通过CDC或ADCC清除CAR－T细胞。目前，NCT03590574临床试验正在研究外周T细胞淋巴瘤（PTCL）中基于RQR8的CAR－T细胞。初步结果显示，ORR为67％，56％的患者实现了完全代谢反应（CMR）。另一项试验NCT03287804因治疗多发性骨髓瘤的初步疗效不理想而终止。
诱导型半胱天冬酶9（iCasp9）的加入是CAR－T安全开关的一种独特方法。在给予AP1903后，特别修饰的胱天蛋白酶9发生二聚并触发凋亡途径。目前，17项临床试验正在评估基于iCasp9的CAR－T细胞，但其中只有4项提供了初始数据。NCT03016377临床试验报告了一例ALL患者在CAR－T输注后出现神经毒性。AP1903给药后，症状完全缓解，唯一的不良事件是持续三天的2级胆红素升高。有趣的是，尽管消除了90％以上的CAR－T细胞，研究人员仍观察到临床上显著的抗白血病反应。在NCT02274584试验中，仅发表了一例霍奇金淋巴瘤患者的病例报告，显示暂时部分缓解。此外，NCT03125577试验报告了4名患者的数据，所有患者在CAR－T输注后出现CR。
另一种可作为CAR－T疗法安全开关的自杀基因是单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV－TK）Mut 2基因，其产物被前药更昔洛韦（GCV）靶向。HSV－TK将GCV转化为GCV三磷酸，通过破坏复制过程导致细胞死亡。在终止的NCT04097301试验中评估了基于HSV－TK的CAR－T细胞。最终，只有两名患者入选，且对治疗无反应。由于缺乏T细胞相关毒性，安全开关未被激活。
通用CAR－T细胞
如今，传统CAR－T产品是由来自符合治疗条件的患者的自体T细胞制造的。该方法存在若干局限性，包括制造时间长、难以动员适当数量的T细胞以及严重治疗患者的T细胞质量降低。然而，利用分子工程产生异基因CAR－T细胞可以克服上述障碍。为了构建通用CAR－T，需要从供体来源的细胞中去除主要组织相容性复合物（MHC）和T细胞受体（TCR）分子。
CRISPR／Cas9技术在T细胞工程中的初步安全性和可行性已在首次人体试验NCT03399448中得到证实。截至2022年8月，在ClinicalTrials．gov上已注册了5项评估抗自相残杀CAR－T细胞的临床试验。在NCT04502446中，针对CD70抗原的CAR－T细胞被设计为消除TCR、MHC－I和CD70的表达，以消除自相残杀并提高疗效。结果显示，ORR为47％，而CR为20％，未观察到严重不良事件。此外，NCT04264078试验提供了在r／r T－ALL患者中使用通用CAR－T细胞的数据。通过CRISPR／Cas9破坏TCR和CD7基因，以防止GvHD和自相残杀。结果显示，CR为80％（4／5），但所有受试者的治疗均与严重CRS相关（4名患者为3级，1名患者为4级）。后续入选患者的结果证实了该治疗的高疗效，CR为83％（5／6），而安全性结果与先前观察结果一致。
小结
随着研究数据的积累和分子工程的广泛应用，新一代CAR－T细胞治疗在临床上逐渐趋于成熟。最成功的新一代CAR－T细胞有可能是通用同种异体CAR－T细胞（使用CRISPR／Cas9技术制造），其特征在于免疫检查点抗性，并表达将T细胞运输到肿瘤部位的细胞因子。此外，这种结构将包含用于管理潜在毒性的安全开关机制。这种组合可能克服CAR－T细胞疗法当前的局限性，并有助于改善患者的治疗结果。
参考文献：
1．Nextgenerations of CAR－T cells － new therapeutic opportunities in hematology？ FrontImmunol．2022 Oct 28；13：1034707．
原文标题 : 新一代CAR-T细胞治疗的临床概况
