前言
嵌合抗原受体（CAR）T细胞在肿瘤免疫治疗具有巨大的潜力。然而，接受CAR-T细胞治疗的患者中有很大一部分不会达到长期完全缓解。其中一个原因在于他们的过早耗竭，这也包括过继转移的CAR-T细胞的代谢无能。耗竭和/或终末分化的CAR-T淋巴细胞的频繁出现可能导致肿瘤浸润不良、持续性有限、缺乏效应器功能，最终导致肿瘤免疫逃逸。
已经证明特别适合CAR-T细胞治疗的T细胞表型显示出某些代谢特征；以自我更新和持久性为特征的T细胞记忆（TSCM）细胞优先通过氧化磷酸化（OXPHOS）来满足其能量需求，效应T细胞（TEFF）依赖糖酵解来支持其细胞毒性功能。CAR-T细胞设计和制造的各种参数共同决定最终细胞产物的代谢概况。
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事实上，T细胞的关键功能甚至分化都与细胞的生物能量学紧密相连。肿瘤细胞及其微环境（TME）反过来可以以多种方式影响T细胞代谢，包括关键营养素（如葡萄糖或色氨酸）的消耗、生物活性代谢物（如乳酸或活性氧）的积累或通过免疫检查点。考虑到T细胞代谢和功能特征之间的紧密联系，这是有效CAR-T细胞治疗的先决条件，因此研究代谢调节作为提高临床疗效甚至耐受性的手段非常有意义。
当前CAR-T细胞治疗的局限性
当前，CAR-T细胞治疗仍面临一些障碍，包括治疗相关的毒性、对实体瘤的疗效有限、靶抗原丢失、肿瘤浸润不良、持续性有限以及免疫抑制性TME。
CAR-T细胞相关毒性
几种CAR相关（即靶抗原、共刺激域）和疾病相关（即肿瘤类型、肿瘤大小、促炎活性）因素决定了治疗相关毒性的发生率和程度。最相关的包括细胞因子释放综合征（CRS）、免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）和长期血液毒性。
实体瘤浸润不良
实体恶性肿瘤的治疗决定性地取决于CAR-T细胞浸润肿瘤部位的能力。克服这一障碍的策略包括局部给药，用对肿瘤衍生趋化因子有反应的趋化因子受体武装CAR-T细胞，以及降解细胞外基质的酶（如肝素酶）的表达。有趣的是，T细胞代谢可以影响细胞运动，从而影响肿瘤组织浸润，糖酵解和OXPHOS都为这一耗能过程提供了能量。此外，某些营养素如色氨酸和精氨酸的耗竭]或TME中乳酸的积累可抑制T细胞运动。
靶抗原丢失
免疫逃逸机制之一是由于免疫压力而导致靶抗原的丢失。应对措施包括开发针对多种肿瘤抗原的多特异性CAR（例如，双CAR或串联CAR）。
免疫抑制性TME
从免疫代谢的角度来看，TME是CAR-T细胞的敌对环境。正常T细胞功能所需的营养物质（如葡萄糖或精氨酸）被耗尽，而有害代谢产物（如犬尿氨酸、活性氧和乳酸）则同时累积。此外，耐受促进细胞亚群的存在，如髓系衍生抑制细胞（MDSCs）、肿瘤相关巨噬细胞（TAM）或调节性T细胞（TRegs），可对抗肿瘤导向的免疫应答。上述因素都会削弱基于T细胞的免疫反应，并导致耗竭。
T细胞分化与代谢之间的联系
CAR-T细胞的治疗效果和持久性与其分化状态显著相关。T细胞分化的不同阶段包括：幼稚T细胞（TN）、干细胞中央记忆T细胞（TSCM）、中央记忆T淋巴细胞（TCM）、效应记忆T细胞、效应T细胞和终末分化T细胞。具有高含量TN、TCM和TSCM细胞的CAR-T细胞产品显示出优异的抗肿瘤反应和体内持久性。T细胞的分化状态和代谢表型紧密相连，因此了解代谢如何影响分化很重要。
当TN离开胸腺时，它们主要依赖葡萄糖衍生丙酮酸或脂肪酸氧化（FAO）提供的OXPHOS一旦进入外周，TN很可能遇到抗原，经历T细胞受体（TCR）激活，并向TEFF细胞分化。尽管存在足够的氧气进行OXPHOS，但该过程与代谢偏向有氧糖酵解并行。这种代谢重编程允许产生快速细胞生长和增殖所需的代谢中间体，并在应激条件下维持细胞氧化还原平衡。这一过程受到关键代谢调节剂哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的严格调控。除了糖酵解，已经证明线粒体活性对支持T细胞效应器功能也很重要。
抗原相遇并成功清除后，TEFF细胞群收缩。然而，一小部分作为长寿记忆T细胞存在，其特征是抗原再暴露后快速激活、增殖和效应器功能。与TEFF细胞相比，雷帕霉素对mTOR的抑制增强了体内记忆T细胞的形成。在这种情况下，5′腺苷一磷酸激活蛋白激酶（AMPK）调节记忆T细胞代谢。记忆T细胞通过FAO和OXPHOS为其能量需求提供燃料。这导致备用呼吸能力（SRC）增加，这使得T细胞能够在压力或营养限制的情况下快速满足能量需求。
不同的T细胞亚群依赖于不同的代谢程序，这些程序决定了基于T细胞的免疫疗法的功能、寿命、持久性以及疗效。一些临床T细胞试验报告了输注分化程度较低的T细胞与更好的临床结果之间的正相关。
TME中的T细胞代谢
T细胞代谢不仅受到T细胞分化和活化状态等的影响，而且还受到肿瘤免疫微环境条件的影响。其中一个原因是活化的T细胞和恶性细胞具有相似的代谢特征，这导致对葡萄糖等营养素的竞争，这种竞争可能会阻碍T细胞反应。
糖酵解肿瘤抑制T细胞功能的另一种间接机制是通过过量乳酸释放。乳酸对T细胞代谢具有抑制作用，特别是糖酵解，这是由于细胞外环境和细胞质之间的乳酸梯度不利。事实上，许多肿瘤衍生代谢副产物具有抑制潜力。TME中钾的积累阻断了T细胞的氨基酸和葡萄糖转运蛋白。肿瘤上高度表达的外核苷酸酶CD39和CD73将细胞外ATP转化为腺苷。后者干扰NfκB信号传导，限制T细胞的抗肿瘤活性并促进TRegs的诱导。腺苷还直接影响T细胞代谢和功能，事实上，腺苷使mTOR靶蛋白S6磷酸化减弱，从而导致糖酵解代谢降低。除了损害新陈代谢，腺苷还减少细胞因子的产生和T细胞脱颗粒活性。此外，TME内脂质（例如胆固醇）浓度的增加会引发所谓的脂质毒性，导致细胞死亡和T细胞耗竭。另一项研究还表明，TME中长链脂肪酸的积累导致胰腺癌T细胞功能障碍。
除了上述分子，TME中的不同细胞因子也对T细胞代谢和分化产生影响。一方面，IL-2通过持续的mTOR激活维持糖酵解转变，这已证明有利于TRegs的产生和抑制活性。另一方面，已知IL-7、IL-15和IL-21等细胞因子通过增加甘油摄取、SRC、CPT1α表达，甚至通过抗氧化分子（谷胱甘肽还原酶、硫氧还蛋白还原酶1、过氧化物酶和超氧化物歧化酶）的表达来驱动线粒体和脂肪酸代谢，从而补偿OXPHOS后ROS的增加。
此外，PD-L1等免疫检查点是肿瘤免疫逃逸的驱动因素。最近的数据表明，它们通过干扰T细胞代谢发挥部分作用。PD-L1与PD-1的结合通过降低糖酵解活性而削弱其效应器功能。这表明，目前采用的免疫检查点阻断可能恢复免疫代谢适应性，需要进一步研究。
CAR设计对T细胞代谢的影响
分化程度较低的T细胞表型似乎有利于CAR-T细胞的临床疗效。某些CAR成分的设计可以共同确定代谢表型和干性。
共刺激域
CAR中使用各种共刺激域，目前大多数构建体属于以下超家族之一：肿瘤坏死因子受体超家族（4-1BB/CD137，OX40）或免疫球蛋白超家族（CD28，ICOS/CD278）。许多比较4-1BB与CD28的研究表明，与CD28相比，4-1BB的基础耗氧率（OCR）更高，这种差异在TCM和TN中最强。相反，代谢通量分析显示CD28 CAR T细胞的细胞外酸化率（ECAR）增强，这是有氧糖酵解的产物。CD28 CAR-T细胞显示参与糖酵解的关键基因表达增加，包括GLUT1、磷酸甘油酸激酶（PGK）和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）。4-1BB CAR-T细胞中增强的FAO、SRC和OXPHOS由增强的线粒体生物发生以及融合支持，这也见于记忆T细胞。这些差异可能来自于每个共刺激域触发的分子通路。这些代谢特征可能解释了4-1BBCAR-T细胞倾向于TCM表型、效应器反应较慢和体内持久性更长的原因。
总体而言， 4-1BB共刺激使CAR-T细胞代谢偏向OXPHOS和FAO，并促进分化程度较低的表型。有趣的是，具有CD28和4-1BB共刺激结构域的第三代CAR-T细胞似乎保持了4-1BB CAR-T的高线粒体代谢，但同时伴随着糖酵解代谢的增加。随着时间的推移，这种总体增强的代谢活性促使双CAR-T细胞中持续的紧张性TCR信号传导、增殖和代谢适应性。
其他CAR相关因素
除了共刺激域，CAR设计的其他方面也可以影响CAR T细胞的代谢。研究表明，泛素化缺陷的CD19 CAR-T细胞表现出较高的OCR和SRC。泛素化的抑制导致CAR构建体循环到表面并增强溶酶体信号传导，从而促进OXPHOS，进而促进记忆T细胞的形成。
靶向CAR-T细胞代谢的策略
随着关于能量代谢对CAR-T细胞功能和持久性的数据越来越多，目前正在开发许多干预策略。
优化细胞培养条件
CAR-T细胞制造过程中的培养条件可以决定分化状态和代谢表型。一个重要因素是补充血清，动物或人类来源的血清是支持细胞生存和生长的培养基的重要组成部分。传统配方包括胎牛血清（FBS）和人血清（HS），最近的研究探讨了用于间充质干细胞（MSCs）扩增的人血小板裂解物（HPL）的用途。在HPL存在下扩增的CAR-T细胞显示出TCM细胞的富集、优异的体内扩增和增强的抗肿瘤活性。此外，作为一种替代方案，血清可以被PhysiologixTM（Phx）代替，这是一种从全血中提取的生长因子。Phx增强了CAR-T细胞的功能性和体内扩增，同时，代谢从糖酵解转向OXPHOS。
另一方面，CAR-T细胞生产的持续时间会影响分化和功能。通常，CAR-T细胞扩增持续9至14天。然而，更短的间隔允许产生具有更高增殖能力、更少分化和更大细胞毒性活性的CAR-T细胞。这些优化方案的范围为3-5天。
CAR T细胞产生最常用的细胞因子是IL-2。然而，IL-2促进糖酵解以快速增殖，但会导致短寿命、高分化和耗竭的CAR -T细胞的形成。替代IL-2的努力集中于替代γ链细胞因子，包括IL-7、IL-15和IL-21。证据支持IL-15通过mTOR抑制来保持细胞干性，并诱导更高的抗肿瘤活性和增殖。干扰mTOR信号导致糖酵解减少，并向OXPHOS转移。此外，IL-21是一个有趣的候选因子，因为它增强了FAO，从而支持TCM细胞的生成和体内持久性。与IL-15相比，IL-21可能产生更好的抗肿瘤活性。其他策略包括IL-21与IL-4和IL-7的组合，这保持了干细胞的稳定性，并减少了CAR-T细胞中抑制性受体（包括PD-1和TIM3）的表达。
干扰糖酵解
TME通常以营养素缺乏为特征，恶性细胞和T细胞争夺生物能量底物。一般来说，营养缺乏对T细胞有害。然而，最近的研究表明，代谢应激，特别是葡萄糖缺乏，可能会促进T细胞的持久性。研究最多的糖酵解抑制剂之一是2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG）。2-DG是一种葡萄糖衍生物，通过葡萄糖转运蛋白进入细胞，然后被糖酵解的启动酶己糖激酶2（HK2）磷酸化。产生的2-DG-6-磷酸不能被进一步代谢，由于终产物抑制，HK2活性显著降低。在体外扩增期间用2-DG处理T细胞有利于记忆T细胞的形成。
此外，在TCR结合时激活的主要途径之一是PI3K/Akt/mTOR信号轴，其促进糖酵解以支持快速T细胞增殖和分化。因此，干扰这种信号通路可能导致分化程度较低的CAR-T细胞。研究测试了在PI3K抑制剂存在下B细胞成熟抗原（BCMA）导向的CAR-T细胞的扩增，将这些CAR-T细胞输注给多发性骨髓瘤小鼠，导致长期肿瘤消退。
促进线粒体代谢
鉴于线粒体代谢与CAR-T细胞的干性和体内持久性有关，目前正在研究几种策略以相应地调节CAR-T细胞的生物能量学。线粒体生物发生的一个关键调节因子是PGC1α。PGC1α由增强的能量需求触发，它通过AMPK激活后的磷酸化激活，并通过DNA结合转录因子（包括核呼吸因子NRF1和NRF2）的结合和激活发挥作用，这些转录因子参与控制线粒体活性增加时产生的过量ROS。在小鼠黑色素瘤模型中，将抗PD-1治疗与PGC1α激动剂benzafibrate联合使用，导致OXPHOS增加，T细胞凋亡减少。
调节线粒体动力学是增强线粒体适应性的另一种策略。如Mdiv-1，一种线粒体分裂抑制剂，或消融基因，如动力蛋白相关的GTPase（DRP1）或线粒体分裂动力蛋白I（DNM1）。这两种方法都导致了融合的线粒体，增加了线粒体的适应性，以及肿瘤浸润淋巴细胞的抗肿瘤活性。
营养支持
考虑到TME内营养素的竞争，目前有几项工作正在关注氨基酸和核苷酸的补充。例如，L-精氨酸可以通过增强OXPHOS和记忆细胞形成，提高体外和体内T细胞的抗肿瘤活性。关于核苷酸，肌苷似乎是一种有吸引力的补充物，因为它有可能进入糖酵解和磷酸戊糖途径。例如，在小鼠模型中，即使在缺乏营养的条件下，它也能提高肿瘤清除率。
小结
尽管CAR-T细胞疗法已经彻底改变了癌症治疗领域，但仍有一些障碍需要克服，包括毒性和疗效。为了克服这些局限性，目前的重点是优化CAR-T细胞设计，包括调节CAR-T细胞活性和毒性、细胞因子介导的CAR-T细胞重定向、通用CAR或武装CAR-T细胞等策略。
除了目前开发的CAR外，还致力于优化CAR-T细胞培养、制造和转移，以改变T细胞适应性和代谢的某些方面。新的证据表明T细胞代谢与功能、分化和持久性之间的存在相互联系。因此，评估代谢调节作为改善CAR-T细胞治疗的策略似乎是不可避免的。CAR的设计，尤其是共刺激域的设计，会强烈影响代谢、表型、持久性，可能还会影响毒性。未来，我们应该更加关注所利用的信号域的代谢影响，此外，还可以进行进一步的基因干预，允许某些关键代谢分子的表达。总的来说，这些方法将产生具有高抗肿瘤活性、保持TME中生存和持久性的干性CAR-T细胞。
参考文献：
1.Roleof CAR T Cell Metabolism for Therapeutic Efficacy. Cancers (Basel).2022Nov 4;14(21):5442.
原文标题 : 靶向CAR-T细胞代谢的策略
关键词：
